Sıvı kromatografi, maddelerin ayrıştırılması için uzun süredir kullanılan yerleşik bir tekniktir. Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), çok çeşitli uygulama alanlarının analizi için uygun bir yöntemdir. Bu yazıda HPLC’nin prensibini açıklıyor, bir HPLC sistemindeki en önemli bileşenleri ve bir ölçümün başarısını belirleyen faktörleri tanıtıyoruz.
HPLC’nin Prensibi
HPLC’nin ayırma prensibi, analiz edilecek maddenin (örnek) mobil faz (elüent) ile sabit faz (kolonun dolgu malzemesi) arasında dağılımına dayanır.
Analitin kimyasal yapısına bağlı olarak, sabit fazdan geçerken moleküller gecikmeye uğrar. Örnek molekülleri ile sabit faz malzemesi arasındaki özgül moleküller arası etkileşimler, moleküllerin kolondaki kalma süresini belirler. Böylece örnekteki farklı bileşenler farklı zamanlarda elüe olur (kolondan çıkar) ve ayrım sağlanır.
Bir dedektör ünitesi (örneğin UV dedektörü), kolon çıkışındaki analitleri algılar. Bu sinyaller bilgisayar yazılımı tarafından işlenir ve kromatogram olarak gösterilir.
Dedektör ünitesinden sonra mobil faz, başka dedektörlere, fraksiyon toplama ünitesine ya da atık hattına yönlendirilebilir.
Genellikle bir HPLC sistemi şu modüllerden oluşur: çözücü haznesi, pompa, enjeksiyon valfi, kolon, dedektör ünitesi ve veri işleme sistemi. [Fig.1]
Gradient (Gradyan) ve İzokratik HPLC Sistemleri
Mobil fazın bileşimine bağlı olarak, genellikle iki farklı mod uygulanır. Eğer mobil fazın bileşimi ayırma süreci boyunca sabit kalıyorsa, sistem “izokritik sistem” olarak tanımlanır. Eğer mobil fazın bileşimi süreç boyunca değiştirilirse, sistem “gradyan sistem” olarak adlandırılır.
Gradyan sistemlerde iki teknik uygulanabilir:
- Düşük basınçlı gradyan (LPG): Çözücülerin karıştırılması pompaya girmeden önce (emiş tarafında) gerçekleşir.
- Yüksek basınçlı gradyan (HPG): Her çözücü ayrı pompa ile verilir ve pompadan sonra (boşaltma tarafında) karıştırılır.
HPLC Kolonları
Kolon, bir HPLC sisteminin kalbidir. Örnekteki bileşenlerin uygun şekilde ayrılmasından sorumludur. Ayrım verimliliği, kolonun iç çapı, uzunluğu ve dolgu malzemesinin tipi/partikül boyutuyla ilişkilidir. Kullanım amacına göre farklı kolonlar mevcuttur:
- Normal faz
- Ters faz
- Boyut ayırıcı (Size Exclusion)
- İyon değişim
- Affinite
- Kiral ayırım
- Hidrofilik etkileşim kromatografi
HPLC Dedektörleri
Dedektör ünitesi, kolondan çıkan maddenin zamanını ve miktarını kaydeder. Elüentin bileşimindeki değişiklikleri algılar ve bu bilgiyi bilgisayar tarafından değerlendirilecek elektriksel sinyale dönüştürür. Kullanılacak dedektör, analitin yapısal özelliklerine bağlı olarak değişir. En yaygın dedektör türleri şunlardır:
- Refraktometrik
- UV/VIS (Ultraviyole / Görünür)
- Elektrokimyasal
- Floresan dedektörler
HPLC Kromatografik Parametreler
Mobil fazla taşınan ayrıştırılmış analitler, dedektör tarafından tepe sinyalleri (pik) olarak kaydedilir. Tüm piklerin toplam miktarı “kromatogram” olarak adlandırılır.
Tüm tepelerin oluşturduğu grafik “kromatogram” olarak adlandırılır. Her bir pik analit hakkında kalitatif (nitel) ve kantitatif (nicel) bilgi verir.
- Kalitatif bilgi: Pik şekli, sinyal yoğunluğu, kromatogramda çıkma zamanı
- Kantitatif bilgi: Pik alanı madde konsantrasyonu ile orantılıdır. Bu nedenle romatografi veri yönetimi yazılımı entegrasyon yoluyla numunenin konsantrasyonu hesaplayabilir.
Bu da kantitatif bilgi sağlar. İdeal olarak pikler Gauss çanı şeklinde bir eğri olarak kaydedilir. Bir kromatografik ayırmanın temel parametreleri aşağıda tartışılmaktadır.
İdeal pikler Gauss çanı şeklinde bir eğri olarak kaydedilir.
Gecikme Süresi (t₀):
Numunenin enjeksiyondan dedektöre ulaşmasına kadar geçen süredir. Bu süreçte moleküller yalnızca mobil fazda bulunur. Tüm bileşenler aynı gecikme süresine sahiptir.
Tutunma Süresi (tᵣ):
Bir bileşiğin enjeksiyondan dedektöre ulaşmasına kadar geçen toplam süredir. Maddenin hem mobil hem de sabit fazda geçirdiği süredir. Maddelere özgüdür ve koşullar sabitken hep aynı kalmalıdır.
Pik Genişliği (w):
Sinyalin başladığı noktadan tekrar tabana düşene kadar olan zaman aralığıdır.
Kaynak: [1]
